Introducción.
Uno de los problemas de la fijación de las muestras con formalina es que la posterior extracción de ADN para análisis genéticos es mucho más difícil. Dada la importancia de los análisis genéticos en estudios modernos de la biodiversidad se hizo cada vez más importante para encontrar metodologías que conservan ejemplares en una condición adecuada para los análisis morfológicos, sino que también permitieron la posterior extracción de ADN. DESS es una solución de 0,25M EDTA disódico a un pH de 8,0 y 20% DMSO (dimetil sulfóxido), saturada con sal (NaCl). DESS ha sido desarrollado para satisfacer los criterios descritos anteriormente (Yoder et al. 2006).
Preparación de DESS.
Lo siguiente se basa en el protocolo enviado a mí por Melissa Yoder, junto con mis comentarios y observaciones personales.
Preparación de la DESS puede llevar mucho tiempo, principalmente debido al tiempo que tarda el EDTA se disuelva. Por tanto, es mejor para preparar un gran volumen de EDTA al doble de molaridad (0,5M EDTA) con antelación.
Preparación de 2L de 0.5M EDTA:
EDTA disódico (372.24g)
5M NaOH (500ml approx.)
Agua destilada (2.5L approx.)
En primer lugar hacer a la solución 5M de NaOH. Añadir 200g de pellets (lentamente!) A 1L de agua destilada. La masa molar de NaOH es 39,99g mol-1, entonces para una solucion de 5M 200g son necesarios. Esta es una reacción exotérmica así que lo mejor es hacer la mezcla en un baño de agua, y añadir los pellets al agua, no el agua de los pellets.
Siguiente disolver 372,24g de EDTA disódico en 500ml de agua destilada. Lo hago en un grande (2L) frasco erlenmeyer sobre una placa de agitación magnética. Es mucho más fácil para añadir el EDTA al agua que a la inversa. A continuación añadimos el NaOH 5M a la mezcla, lentamente, para llevar el pH hasta 8,0. Obviamente, esto es mucho más fácil si usted tiene un medidor de pH que se puede colgar en la solución, también asegúrese de que el medidor de pH se calibra adecuadamente antes de empezar. Añadir el NaOH 5M lentamente, ya que es fácil de pasar de largo. Añadir pequeñas cantidades a la vez y permite la lectura en el medidor se asiente antes de añadir más, a medida que se acerque a un pH de 8.o agrega el NaOH 5M con más cautela. El EDTA disódico comenzará a disolverse alrededor de pH 7,0. Sea paciente puede tomar varias horas para que el EDTA disódico se disuelva. Si no se utiliza EDTA disódico se requerirá más NaOH 5M para alcanzar una pH de 8.0. Una vez que el EDTA disódico se ha disuelto llevar la solución hasta un volumen final de 2L con agua destilada.
Preparación de 2L de DESS:
0.5M EDTA disódico (1L)
Dimetil sulfóxido (DMSO) (400ml)
Agua destilada (600ml)
NaCl (300g approx.)
Mezclar las tres primeras soluciones juntos en un frasco erlenmeyer de 2L en una placa de agitación magnética. A continuación, añadir NaCl suficiente para saturar la solución. Añadir el 300g y esperar a que se disuelva, a continuación, añadir un poco más y esperar a que se disuelva, repetir hasta que no más sal se disuelve en la solución. El exceso de sal se acumula en el fondo del recipiente de almacenamiento, esto es normal, simplemente filtrarlo antes de agregar el DESS a sus muestras.
Uso de DESS en terreno.
Adición de DESS directamente a una muestra ya está lleno del agua de mar probablemente diluir la solución por lo que es menos eficaz. (Nota: Esto es mi suposición, que en realidad no lo he probado para averiguar!). Extracción del agua de mar de la muestra, ya sea por gravedad o centrifugación, es ya sea consume demasiado tiempo o poco práctico en terreno. En la Antártida se recogieron muestras cualitativas para la fijación con DESS, éstos fueron trasladados al laboratorio de la estación de terreno o en otro lugar adecuado y se extrajeron los meiofauna. En primer lugar por decantación con 45μm agua de mar filtrada y luego por una segunda ronda de decantación después de 15 minutos de anaesthetisation en cloruro de magnesio isotónica (MgCl2). Después de la extracción los meiofauna se fijaron con un exceso de DESS.
Trabajando con DESS en el laboratorio.
El único problema con el trabajo con DESS en el laboratorio son los cristales de sal. Si usted tiene un espécimen que se cubre o se incrusta en los cristales de sal simplemente transferirlo a agua destilada durante unas horas, luego transferirlo de nuevo a una solución fresca de DESS.
Observaciones sobre DESS con distintos grupos de meiofauna.
(23/07/2012)DESS ha funcionado bien hasta ahora con los nematodos, hemos sido capaces de utilizar con éxito las muestras fijadas DESS como habíamos planeado en el proyecto de la Antártida. Las muestras eran identificables después de la fijación con DESS, en comparación con las muestras fijadas con formalina ellos fueron un poco más blandos pero perfectamente utilizable. Los ejemplares identificados fueron sometidos posteriormente a un análisis genético para el desarrollo de códigos de barras de ADN.
Uno de los grupos que no aparece bien fijadas en DESS es la Turbellaria. Las muestras se convierten en trozos de gelatina con la forma de turbellaria. Oligochaeta eran identificables pero no en buenas condiciones. Voy a informar sobre otros grupos como y cuando aparecen en muestras fijadas en DESS.
Referencias.
Yoder, M.; Tandingan De Ley, I.; King, I.; Mundo-Ocampo, M.; Mann, J.; Blaxter, M.; Poiras, L. & De Ley, P. (2006) DESS: a versatile solution for preserving morphology and extractable DNA of nematodes. Nematology 8:367-376.