{"id":254,"date":"2016-06-01T20:51:57","date_gmt":"2016-06-01T20:51:57","guid":{"rendered":"http:\/\/newsite.matthewlee.org\/?page_id=254"},"modified":"2016-06-01T20:52:34","modified_gmt":"2016-06-01T20:52:34","slug":"fijacion-con-dess","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/meiochile.matthewlee.org\/?page_id=254","title":{"rendered":"Fijaci\u00f3n con DESS"},"content":{"rendered":"

Introducci\u00f3n<\/strong>.<\/h2>\n

Uno de los problemas de la fijaci\u00f3n de las muestras con formalina es que la posterior extracci\u00f3n de ADN para an\u00e1lisis gen\u00e9ticos es mucho m\u00e1s dif\u00edcil. Dada la importancia de los an\u00e1lisis gen\u00e9ticos en estudios modernos de la biodiversidad se hizo cada vez m\u00e1s importante para encontrar metodolog\u00edas que conservan ejemplares en una condici\u00f3n adecuada para los an\u00e1lisis morfol\u00f3gicos, sino que tambi\u00e9n permitieron la posterior extracci\u00f3n de ADN. DESS es una soluci\u00f3n de 0,25M EDTA dis\u00f3dico a un pH de 8,0 y 20% DMSO (dimetil sulf\u00f3xido), saturada con sal (NaCl). DESS ha sido desarrollado para satisfacer los criterios descritos anteriormente (Yoder et al. 2006).<\/p>\n

Preparaci\u00f3n de\u00a0DESS<\/strong>.<\/h2>\n

Lo siguiente se basa en el protocolo enviado a m\u00ed por Melissa Yoder, junto con mis comentarios y observaciones personales.<\/p>\n

Preparaci\u00f3n de la DESS puede llevar mucho tiempo, principalmente debido al tiempo que tarda el\u00a0EDTA<\/a>\u00a0se disuelva. Por tanto, es mejor para preparar un gran volumen de EDTA al doble de molaridad (0,5M EDTA) con antelaci\u00f3n.<\/p>\n

Preparaci\u00f3n de\u00a02L de\u00a00.5M EDTA<\/em>:<\/p>\n

EDTA dis\u00f3dico (372.24g)<\/p>\n

5M NaOH (500ml approx.)<\/p>\n

Agua destilada\u00a0(2.5L approx.)<\/p>\n

En primer lugar hacer a la soluci\u00f3n 5M de NaOH. A\u00f1adir 200g de pellets\u00a0(lentamente!) A 1L de agua destilada. La masa molar de\u00a0NaOH es\u00a039,99g mol-1<\/sup>, entonces para una solucion de\u00a05M 200g son necesarios. Esta es una reacci\u00f3n exot\u00e9rmica as\u00ed que lo mejor es hacer la mezcla en un ba\u00f1o de agua, y a\u00f1adir los\u00a0pellets\u00a0al agua, no el agua de los pellets.<\/p>\n

Siguiente disolver 372,24g de EDTA dis\u00f3dico en 500ml de agua destilada. Lo hago en un grande (2L) frasco erlenmeyer sobre una placa de agitaci\u00f3n magn\u00e9tica. Es mucho m\u00e1s f\u00e1cil para a\u00f1adir el EDTA al agua que a la inversa. A continuaci\u00f3n a\u00f1adimos el NaOH 5M a la mezcla, lentamente, para llevar el pH hasta 8,0. Obviamente, esto es mucho m\u00e1s f\u00e1cil si usted tiene un medidor de pH que se puede colgar en la soluci\u00f3n, tambi\u00e9n aseg\u00farese de que el medidor de pH se calibra adecuadamente antes de empezar. A\u00f1adir el NaOH 5M lentamente, ya que es f\u00e1cil de\u00a0pasar de largo. A\u00f1adir peque\u00f1as cantidades a la vez y permite la lectura en el medidor se asiente antes de a\u00f1adir m\u00e1s, a medida que se acerque a un pH de 8.o agrega el NaOH 5M con m\u00e1s cautela. El EDTA dis\u00f3dico comenzar\u00e1 a disolverse alrededor de pH 7,0. Sea paciente puede tomar varias horas para que el EDTA dis\u00f3dico se disuelva. Si no se utiliza EDTA dis\u00f3dico se requerir\u00e1 m\u00e1s NaOH 5M para alcanzar una\u00a0pH de 8.0. Una vez que el EDTA dis\u00f3dico se ha disuelto llevar la soluci\u00f3n hasta un volumen final de 2L con agua destilada.<\/p>\n

Preparaci\u00f3n de\u00a02L de\u00a0DESS<\/em>:<\/p>\n

0.5M EDTA dis\u00f3dico (1L)<\/p>\n

Dimetil sulf\u00f3xido (DMSO<\/a>) (400ml)<\/p>\n

Agua destilada\u00a0(600ml)<\/p>\n

NaCl (300g approx.)<\/p>\n

Mezclar las tres primeras soluciones juntos en un frasco erlenmeyer\u00a0de 2L en una placa de agitaci\u00f3n magn\u00e9tica. A continuaci\u00f3n, a\u00f1adir NaCl suficiente para saturar la soluci\u00f3n. A\u00f1adir el 300g y esperar a que se disuelva, a continuaci\u00f3n, a\u00f1adir un poco m\u00e1s y esperar a que se disuelva, repetir hasta que no m\u00e1s sal se disuelve en la soluci\u00f3n. El exceso de sal se acumula en el fondo del recipiente de almacenamiento, esto es normal, simplemente filtrarlo antes de agregar el DESS a sus muestras.<\/p>\n

Uso de\u00a0DESS en terreno.<\/strong><\/h2>\n

Adici\u00f3n de DESS directamente a una muestra ya est\u00e1 lleno del agua de mar probablemente diluir la soluci\u00f3n por lo que es menos eficaz. (Nota: Esto es mi suposici\u00f3n, que en realidad no lo he probado para averiguar!). Extracci\u00f3n del agua de mar de la muestra, ya sea por gravedad o centrifugaci\u00f3n, es ya sea consume demasiado tiempo o poco pr\u00e1ctico en terreno. En la Ant\u00e1rtida se recogieron muestras cualitativas para la fijaci\u00f3n con DESS, \u00e9stos fueron trasladados al laboratorio de la estaci\u00f3n de terreno\u00a0o en otro lugar adecuado y se extrajeron los meiofauna. En primer lugar por decantaci\u00f3n con 45\u03bcm agua de mar filtrada y luego por una segunda ronda de decantaci\u00f3n despu\u00e9s de 15 minutos de anaesthetisation en cloruro de magnesio isot\u00f3nica (MgCl2<\/sub>). Despu\u00e9s de la extracci\u00f3n los meiofauna se fijaron con un exceso de DESS.<\/p>\n

Trabajando con\u00a0DESS en el laboratorio<\/strong>.<\/h2>\n

El \u00fanico problema con el trabajo con DESS en el laboratorio son los cristales de sal. Si usted tiene un esp\u00e9cimen que se cubre o se incrusta en los cristales de sal simplemente transferirlo a agua destilada durante unas horas, luego transferirlo de nuevo a una soluci\u00f3n fresca de\u00a0DESS.<\/p>\n

Observaciones sobre\u00a0DESS con distintos grupos de\u00a0meiofauna.<\/strong><\/h2>\n

(23\/07\/2012)DESS ha funcionado bien hasta ahora con los nematodos, hemos sido capaces de utilizar con \u00e9xito las muestras fijadas DESS como hab\u00edamos planeado en el proyecto de la Ant\u00e1rtida. Las muestras eran identificables despu\u00e9s de la fijaci\u00f3n con DESS, en comparaci\u00f3n con las muestras fijadas con formalina ellos fueron un poco m\u00e1s blandos pero perfectamente utilizable. Los ejemplares identificados fueron sometidos posteriormente a un an\u00e1lisis gen\u00e9tico para el desarrollo de c\u00f3digos de barras de ADN.<\/p>\n

Uno de los grupos que no aparece bien\u00a0fijadas en DESS es la Turbellaria. Las muestras se convierten en trozos de gelatina con la forma de turbellaria. Oligochaeta eran identificables pero no en buenas condiciones. Voy a informar sobre otros grupos como y cuando aparecen en muestras fijadas en DESS.<\/p>\n

Referencias<\/strong>.<\/h2>\n

Yoder, M.; Tandingan De Ley, I.; King, I.; Mundo-Ocampo, M.; Mann, J.; Blaxter, M.; Poiras, L. & De Ley, P. (2006) DESS: a versatile solution for preserving morphology and extractable DNA of nematodes. Nematology<\/em> 8:<\/strong>367-376.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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